常压室温等离子体诱变技术选育曲霉型豆豉发酵菌种研究（三） 体诱仅下降0.4％、变技0.6％

4、常压突变株遗传稳定性验证

由图3可知，室温术选随着传代次数的等离豆豉增多，突变株NCU—A38、体诱NCU—A17出现了一定程度的变技衰退，产酶能力有所下降，育曲研究集中出现在传代6次以后，霉型最终在第九代分别下降至696.4 U/g、发酵661.2U/g，菌种下降幅度分别为8.3％、常压7.7％；而突变株NCU—A55和原始菌株经过9代传代培养后，室温术选中性蛋白酶活分别为739.0U/g ，等离豆豉604.0U／g，体诱仅下降0.4％、变技0.6％，育曲研究下降幅度较小，遗传稳定性良好。综合考虑突变株产中性蛋白酶活力及遗传稳定性，选取突变株NCU—A55进行后续研究。
 

5、突变株NCU—A55与原始菌株生长性能及产蛋白酶系活力对比

（1）突变株NCU—A55与原始菌株形态观察

ARTP对微生物遗传物质造成高度损伤，能在短时间构建大容量突变库，其遗传物质的改变一般会体现在表型上。如图4所示，原始菌株经ARTP诱变后，其菌落形态发生了非常明显的变化。诱变前，菌落中间凸起，菌落中心孢子分布稀疏，为淡黄色；诱变后的菌落大而平坦，菌落中心孢子分布饱满，呈黄绿色，显示出突变菌株具有更快的生长速度。而从图5可以看出，高倍显微镜下观察到突变株NCU A55菌丝的分化枝点相对原始菌株更多，菌丝繁殖能力更强；低倍显微镜下观察到突变株NCU—A55菌丝的分生孢子头比原始菌株较多且更密集，产孢子能力更强。这与司晓光研究结果较为一致，其采用AIHP诱变技术选育得到一株高产酸性蛋白酶的突变株B一2，菌丝较原始菌株短，分生孢子头多，产孢子较快，在固态发酵过程中突变株B一2的生长速率明显优于出原始菌株。Veerana等人报道，热效应常压等离子体诱变通过刺激孢子溶胀、细胞膜去极化、激活钙和一些萌发相关基因，促进了米曲霉孢子萌发能力的增强。由此看来，突变株生长速度加快，产孢子增多的有利表型不一定是因为ARTP作用于细胞核酸水平的分子结构而引起菌体遗传物质的改变，进而影响突变株的生长代谢；也有可能是由于ARTP作用改变质膜通透性，使得细胞基质产生大量活性氧等成分进入细胞，与生物大分子相互作用，从而改变大分子构象及活性，进而导致突变株代谢途径的改变，并有可能会影响到菌体产蛋白酶能力。

（2）突变株NCU—A55与原始菌株产孢子能力对比

如图6所示，突变株NCU—A55与原始菌株种曲培养基上的产孢子量在60h前并无显著性差异，但在72～84h时，突变株NCU—A55产孢子量显著高于原始菌株（P＜0.05），并在72h时，突变株NCU—A55孢子量达到10.25×109CFU/g，较原始菌株提高了39.3％，并达到企业对种曲的使用要求。基于突变株与原始菌株形态对比的基础上，进一步证实了突变株NCU—A55产生了有利的表型，其产孢子能力较原始菌株显著增强，有研究表明产孢子能力增强有利于促进蛋白酶的分泌。曹晓梅采用ARTP结合化学诱变手段选育高产阿维菌素的突变株也得到了类似的结果，正突变菌株表现为褶皱多，孢子丰满，且与目标产物呈正相关。

（3）蛋白酶系对比

由图7a可知，突变株NCU—A55与原始菌株的中性蛋白酶活力制曲60h前并无显著性差异，在60～84h时，突变株的中性蛋白酶活力显著高于原始菌株，并在60h突变株的中性蛋白酶活力最高，达到958.8U/g，较原始菌株酶活力提升了14.7％；由图7b和7c可知，突变株碱性蛋白酶活力和酸性蛋白酶活力最大值分别出现在制曲60h、72h，达到435.9U/g、109.1U/g，比原始菌株下降13.5％、提升了14.2％。实验结果与曹小琴利用低能N+离子束注入技术选育酱油酿造用菌米曲霉结果较为一致，其选育的米曲霉突变株蛋白酶活力比原始菌株提高了36％，而本实验中，采用新型的离子束注入技术，ARTP诱变原始菌株，选育得到的米曲霉突变株其中性、酸性蛋白酶活力均显著提升，其可能的原因是等离子体中的活性粒子作用于菌株细胞，导致菌株细胞壁和细胞膜的结构及通透性发生改变并引起基因损伤，从而引起菌体一系列的生理变化，扩大了该菌株自身对于碳氮比的需求，但有关碱性蛋白酶活性下降的原因还有待进一步的研究。

三、结论

ARTP诱变米曲霉菌株NCU一110效果明显，诱变选育得到突变株NCU—A55，浅盘制曲复筛实验证实其中性蛋白酶活力较原始菌株提升了21.0％，曲醅酶活力达到741.6U/g，遗传稳定性良好。蛋白酶系对比实验进一步表明突变株NCU—A55蛋白酶系以中性酶活力为主的特点，且蛋白酶系完整。在制曲60h时中性蛋白酶活力最高，达到958.8U／g，酶活力较初始菌株酶显著提升14.7％；通过形态观察及产孢子能力对比，发现突变株NCU A55具有菌丝生长速度快、产孢子能力显著增强的有利表型。本试验为米曲霉菌种的改良提供了新思路，为曲霉型豆豉生产提供了一株生长速度快、产中性蛋白酶高活力的优良菌种。后续实验可进一步探究其高产中性蛋白酶的机理及对原料的利用效率和发酵豆豉的风味、滋味特点。

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